23 resultados para CD4 cell count
em Université de Montréal, Canada
Resumo:
Les progresseurs lents du VIH-1 sont de rares sujets asymptomatiques pendant plusieurs annes sans thrapie antirtrovirale. Parmi ces sujets progression lente vers le SIDA, il est possible quun sous-groupe perde le contrle de leur infection aprs plusieurs annes de contrle. Notre laboratoire a analys lexpression diffrentielle de diffrentes protines et voies molculaires associes la perte de contrle de linfection: linterleukine-32 (IL-32) est une cytokine pro-inflammatoire dont le niveau des isoformes alpha et delta a significativement diminu chez les progresseurs lents lors de la perte de contrle. Par ailleurs, des tudes antrieures ont attribu, de faon intrigante, lIL-32 aussi bien des proprits anti-VIH-1 que des proprits immunosuppressives induisant un environnement propice la rplication du VIH-1. Ce projet de maitrise sest pench sur limplication de lIL-32 dans la progression de linfection VIH-1 avec un accent particulier sur les progresseurs lents. Nous avons principalement mesur les niveaux dIL-32 des sujets sropositifs comparativement aux sujets VIH ngatif et estim les fonctions de cette cytokine travers des tudes longitudinales et de corrlation. Nous avons observ que lIL-32 total demeure plus lev chez les sropositifs comparativement aux sujets VIH ngatif. galement, linfection par le VIH-1 entraine une augmentation du niveau dIL-32 total. De plus, aprs une anne de thrapie antirtrovirale, les taux plasmatiques dIL-32 total demeurent significativement plus levs que ceux des sujets VIH ngatif. Comme attendu, le taux dIL-32 total augmente lors de la perte de contrle de linfection chez les progresseurs lents. Une forte concentration plasmatique dIL-32 total concide avec: 1) une augmentation du taux plasmatique de sCD14 et de la cytokine pro-inflammatoire IL-6, 2) une baisse du compte cellulaire CD4 et une augmentation de la charge virale. Un taux plasmatique lev de CCL5 pourrait prdire une faible concentration dIL-32 total. Lisoforme alpha de lIL-32 est plus leve dans le plasma des sujets VIH ngatif tandis que lIL-32 gamma semble induire un environnement pro-inflammatoire et immunosuppressif. Il ressort lissue de ces observations que laugmentation de lIL-32 total est associe la progression de linfection VIH-1 et pourrait constituer un biomarqueur permettant dapprcier le pronostic de cette infection.
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Affiliation: Mark Daniel: Dpartement de mdecine sociale et prventive, Facult de mdecine, Universit de Montral et Centre de recherche du Centre hospitalier de l'Universit de Montral
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Lobjectif de cette tude tait de dterminer limpact dune infection intra-mammaire (IIM) subclinique cause par staphylocoque coagulase-ngative (SCN) ou Staphylococcus aureus diagnostique durant le premier mois de lactation chez les taures sur le comptage de cellules somatiques (CCS), la production laitire et le risque de rforme durant la lactation en cours. Des donnes bactriologiques provenant dchantillons de lait composites de 2 273 taures Holstein parmi 50 troupeaux ont t interprtes selon les recommandations du National Mastitis Council. Parmi 1 691 taures rencontrant les critres de slection, 90 (5%) taient positives S. aureus, 168 (10%) taient positives SCN et 153 (9%) taient ngatives (aucun agent pathogne isol). Le CCS transform en logarithme nprien (lnCCS) a t modlis via une rgression linaire avec le troupeau comme effet alatoire. Le lnCCS chez les groupes S. aureus et SCN tait significativement plus lev que dans le groupe tmoin de 40 300 jours en lait (JEL) (P < 0.0001 pour tous les contrastes). La valeur journalire du lnSCC chez les groupes S. aureus et SCN tait en moyenne 1.2 et 0.6 plus lev que le groupe tmoin respectivement. Un modle similaire a t ralis pour la production laitire avec lge au vlage, le trait gntique li aux parents pour la production laitire et le logarithme nprien du JEL de la pese inclus. La production laitire ntait pas statistiquement diffrente entre les 3 groupes de culture de 40 300 JEL (P 0.12). Les modles de survie de Cox ont rvl que le risque de rforme ntait pas statistiquement diffrent entre le groupe S. aureus ou SCN et le groupe tmoin (P 0.16). La prvention des IIM causes par SCN et S. aureus en dbut de lactation demeure importante tant donn leur association avec le CCS durant la lactation en cours.
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Le cancer pithlial de lovaire (CO) est le cancer gyncologique le plus ltal. Le CO de type sreux, la forme la plus commune avec plus de 50% des cas, est souvent diagnostiqu tardivement et associ un mauvais pronostic. Le CO avanc, surtout trait par chimiothrapie, va devenir chimiorsistant chez la majorit des patientes traites. Bien que des lignes cellulaires du CO aient t drives partir de tumeurs solides et dascites de patientes ayant ou non subi une chimiothrapie, aucune des lignes cellulaires du CO provenant dune mme patiente avant et aprs ses traitements de chimiothrapie nont t tablies prcdemment. Notre laboratoire est le premier dvelopper de telles lignes cellulaires. Nos nouvelles lignes cellulaires sont drives de trois patientes diffrentes (1369, 2295 et 3133) et classes selon leur provenance, soit la tumeur solide (TOV) ou lascite (OV). Nous avons donc caractris ces nouvelles lignes de cellules pr-chimiothrapie (TOV1369TR, OV2295, TOV3133D et TOV3133G) et post-chimiothrapie (OV1369(2), OV2295(2), TOV2295, OV3133 et OV3133(2)) par diverses approches. Par immunohistochimie et immunobuvardage de type Western, nous avons caractris les niveaux dexpression de marqueurs pithliaux typiques de kratines (KRT7, KRT8, KRT18, KRT19, KRT20) pour confirmer lorigine pithliale et ovarienne des cellules. Nous avons galement analys le niveau dexpression de HER2 et p53, deux marqueurs importants dans le CO. Cependant, il ne semble pas y avoir dexpression diffrentielle vidente de ces marqueurs entre les lignes pr-chimiothrapie et post-chimiothrapie. Plus encore, nous avons tudi plusieurs caractristiques tumorigniques des lignes cellulaires, dont la prolifration cellulaire (par compte cellulaire), la migration cellulaire (par recouvrement de plaie), la capacit former des sphrodes en 3D (par la mthode des gouttelettes inverses), et la formation de tumeurs in vivo dans des souris SCID (xnogreffes sous-cutanes). En gnral, il ne semble pas y avoir de diffrences claires entre les cellules pr-chimiothrapie et post-chimiothrapie au niveau du comportement cellulaire, lexception du fait quaucune des lignes post-chimiothrapie semblent tre en mesure de former des structures tridimensionnelles compactes, contrairement certaines lignes post-chimiothrapie. Nos rsultats pourront servir mieux comprendre les diffrents mcanismes rgissant les tumeurs malignes du CO de type sreux et mieux comprendre la progression de la maladie travers les diffrents traitements, ce qui nous permettra dacqurir des informations essentielles pour mieux valuer et traiter diffrentes patientes.
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La mammite subclinique est un problme de sant frquent et coteux. Les infections intra-mammaires (IIM) sont souvent dtectes laide de mesures du comptage des cellules somatiques (CCS). La culture bactriologique du lait est cependant requise afin didentifier le pathogne en cause. cause de cette difficult, pratiquement toutes les recherches sur la mammite subclinique ont t centres sur la prvalence dIIM et les facteurs de risque pour lincidence ou llimination des IIM sont peu connus. Lobjectif principal de cette thse tait didentifier les facteurs de risque modifiables associs lincidence, llimination et la prvalence dIIM dimportance dans les troupeaux laitiers Canadiens. En premier lieu, une revue systmatique de la littrature sur les associations entre pratiques utilises la ferme et CCS a t ralise. Les pratiques de gestion constamment associes au CCS ont t identifies et diffrenties de celles faisant lobjet de rapports anecdotiques. Par la suite, un questionnaire bilingue a t dvelopp, valid, et utilis afin de mesurer les pratiques de gestion dun chantillon de 90 troupeaux laitiers canadiens. Afin de valider loutil, des mesures de rptabilit et de validit des items composant le questionnaire ont t analyses et une valuation de lquivalence des versions anglaise et franaise a t ralise. Ces analyses ont permis didentifier des items problmatiques qui ont du tre recatgoriss, lorsque possible, ou exclus des analyses subsquentes pour assurer une certaine qualit des donnes. La plupart des troupeaux tudis utilisaient dj la dsinfection post-traite des trayons et le traitement universel des vaches au tarissement, mais beaucoup des pratiques recommandes ntaient que peu utilises. Ensuite, les facteurs de risque modifiables associs lincidence, llimination et la prvalence dIIM Staphylococcus aureus ont t investigus de manire longitudinale sur les 90 troupeaux slectionns. Lincidence dIIM semblait tre un dterminant plus important de la prvalence dIIM du troupeau comparativement llimination des IIM. Le port de gants durant la traite, la dsinfection pr-traite des trayons, de mme quune condition adquate des bouts de trayons dmontraient des associations dsirables avec les diffrentes mesures dIIM. Ces rsultats viennent souligner limportance des procdures de traite pour lobtention dune rduction long-terme de la prvalence dIIM. Finalement, les facteurs de risque modifiables associs lincidence, llimination et la prvalence dIIM staphylocoques coagulase-ngatif (SCN) ont t tudis de manire similaire. Cependant, afin de prendre en considration les limitations de la culture bactriologique du lait pour lidentification des IIM causes par ce groupe de pathognes, une approche semi-Bayesienne laide de modles de variable classe latente a t utilise. Les estims non-ajust de lincidence, de llimination, de la prvalence et des associations avec les expositions apparaissaient tous considrablement biaiss par les imperfections de la procdure diagnostique. Ce biais tait en gnral vers la valeur nulle. Encore une fois, lincidence dIIM tait le principal dterminant de la prvalence dIIM des troupeaux. Les litires de sable et de produits du bois, de mme que laccs au pturage taient associs une incidence et une prvalence plus basse de SCN.
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Les dyskinsies tardives (DT) sont des troubles moteurs associs lutilisation chronique des antagonistes des rcepteurs dopaminergiques D2 tels que les antipsychotiques et le mtoclopramide. Ces dyskinsies correspondent une incoordination motrice portant prfrentiellement sur la musculature oro-faciale. La gestion des DT s'est impose comme dfi de sant publique surtout en labsence dune alternative thrapeutique efficace et abordable. Lhypothse classiquement avance pour expliquer la physiopathologie des DT inhrente au traitement par les antipsychotiques sarticule autour de lhypersensibilit des rcepteurs dopaminergiques D2, cibles principales de ces molcules. Nanmoins, plusieurs donnes remettent la vracit de cette hypothse en question. Hypothse: nous proposons que le blocage chronique des rcepteurs dopaminergiques soit effectivement responsable dun phnomne dhypersensibilisation mais contrairement lhypothse classique, cette hypersensibilisation porterait sur des paramtres de la transmission dopaminergique autres que les rcepteurs D2. De mme nous postulons que cette hypersensibilisation se traduirait par des altrations des cascades signaltiques au niveau des cellules du striatum. Ces altrations aboutissent des changements portant sur le rcepteur nuclaire (Nur77), qui est hautement associ au systme dopaminergique; linduction de ces rcepteurs dclencherait des cascades associes la compensation ou la gense des DT. Matriels et mthodes: 23 femelles Cebus apella, rparties en 3 groupes: groupe halopridol, groupe clozapine, et groupe contrle, ont t exposes aux traitements respectifs pendant 6-36 mois. Aprs lanalyse comportementale, les animaux ont t dcapits et leurs cerveaux isols pour fin danalyse. Hybridation in situ: nous avons fait appel cette technique pour mesurer lexpression de lARNm de Nur77 et du neuropeptide enkphaline. Hybridation in situ double: nous avons exploits cette technique pour identifier les populations neuronales exprimant les rcepteurs dopaminergiques D3 et localiser leur ventuelle induction. Autoradiographies des rcepteurs dopaminergiques D1, D2 et D3 et autoradiographies des rcepteurs i glutamatergiques mGluR5. Ces autoradiographies avaient pour objectif dvaluer lexpression de ces diffrents rcepteurs. Mutagense dirige et transfection cellulaire: nous faisons appel ces techniques pour reproduire le polymorphisme identifi au niveau de la rgion 3UTR de lARNm Nur77 et valuer limpact que pourrait avoir ce polymorphisme sur la stabilit de lARNm Nur77 sinon sur lexpression de la protine Nur77. Western Blot des kinases ERK 1 et 2: cette technique nous a servi comme moyen pour quantifier lexpression globale de ces kinases. Analyses statistiques: lexpression de lARNm Nur77 a t value en utilisant lanalyse de la variance un seul facteur (One way ANOVA). Nous avons procd de la mme faon pour mesurer lexpression des rcepteurs D2, D3 et mGluR5. Rsultats: le groupe des animaux traits par lhalopridol montre une plus forte expression des rcepteurs D3 par rapport aux sujets des autres groupes. Cette expression se produit au niveau des neurones de la voie directe. De plus, cette augmentation corrle positivement avec la svrit des DT. Lexpression des rcepteurs D2 et mGluR5 reste relativement inchange entre les diffrents groupes, alors quun gradient dexpression a t observ pour le rcepteur D1. Par ailleurs, Nur77 est induit par lhalopridol, alors que son expression semble baisser chez les animaux traits par la clozapine. Linduction de lexpression de Nur77 par lhalopridol est plus accrue chez les animaux non dyskintiques. Les animaux traits par la clozapine dmontrent une expression amoindrie de lARNm de Nur77 qui tend tre plus faible que lexpression de base. Dautre part, la prsence du polymorphisme au niveau de la rgion 3UTR semble affecter lexpression cellulaire de Nur77. Conclusion: ces rsultats confortent notre hypothse concernant lexistence dun phnomne dhypersensibilisation prenant place suite un traitement chronique par les antipsychotiques. Ce phnomne sest traduit par une augmentation de lexpression des rcepteurs D3 sans porter sur les rcepteurs D2 tel que prn classiquement. Cette hypersensibilisation des rcepteurs D3 implique galement lexistence dun dbalancement des voies striatales pouvant ainsi sous tendre lapparition des DT. Ces rsultats dvoilent ainsi un nouveau mcanisme qui pourrait contribuer lapparition des DT et pourraient permettre une meilleure gestion, nous lesprons, des DT lchelle clinique.
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Avec la mise en place de la nouvelle limite maximale de 400 000 cellules somatiques par millilitres de lait (c/mL) au rservoir, le mois daot 2012 a marqu une tape importante en termes de qualit du lait pour les producteurs de bovins laitiers du Canada. Lobjectif de cette tude consistait en ltablissement dun modle de prdiction de la violation de cette limite au rservoir laide des donnes individuelles et mensuelles de comptages en cellules somatiques (CCS) obtenues au contrle laitier des mois prcdents. Une banque de donne DSA comprenant 924 troupeaux de laitiers qubcois, en 2008, a t utilise pour construire un modle de rgression logistique, adapt pour les mesures rptes, de la probabilit dexcder 400 000 c/mL au rservoir. Le modle final comprend 6 variables : le pointage linaire moyen au test prcdent, la proportion de CCS > 500 000 c/mL au test prcdent, la production annuelle moyenne de lait par vache par jour, le nombre de jours en lait moyen (JEL) au test prcdent ainsi que les proportions de vaches saines et de vaches infectes de manire chronique au test prcdant. Le modle montre une excellente discrimination entre les troupeaux qui excdent ou nexcdent pas la limite lors dun test et pourrait tre aisment utilis comme outil supplmentaire de gestion de la sant mammaire la ferme.
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Lencphalopathie hpatique (EH) est une complication neuropsychiatrique de la maladie de foie telle que la cirrhose, caractrise par des dysfonctions cognitives et motrices. Le seul traitement curatif est la transplantation hpatique (TH). Historiquement, lEH est considre comme un dsordre mtabolique rversible et il est attendu quil soit rsolu suivant la TH. Cependant, il a t dmontr que des complications neurologiques persistent chez 47% des patients transplants. La TH est une opration chirurgicale complexe accompagne de stress pri-opratoire telle que la perte sanguine et lhypotension. Lhypothse de ce projet dtude est que lEH minimale (EHm) rend le cerveau plus susceptible une perte neuronale suite une insulte hypotensive. Nous avons donc caractris un modle dhypotension chez des rats cirrhotiques avec ligation de la voie biliaire (BDL) dans lequel une hypovolmie de lartre fmorale a t faite. Avec ce modle, nous avons tudi limpact de diffrentes pressions sanguines de 120 minutes sur le compte neuronal. Nos rsultats dmontrent que les BDL hypotendus une pression artrielle moyenne de 60 mmHg et 30 mmHg ont une diminution du compte neuronal et que les neurones mourraient par apoptose (observe par la prsence de caspase-3 clive). Nous avons galement dtermin que le flot sanguin crbral tait altr chez les rats cirrhotiques BDL. Le second objectif tait dvaluer si le traitement de lEHm par lornithine phnylactate (OP) permettait dviter la perte neuronale chez les BDL hypotendus. Nos rsultats ont dmontrs que lOP permettait de partiellement rtablir les fonctions cognitives chez les rats BDL. De plus, les rats BDL traits avec lOP peuvent viter la mort neuronale. Cependant, le processus apoptotique est toujours enclench. Ce rsultat suggre la possibilit de mort cellulaire retarde par lOP. Ces rsultats suggrent que les patients cirrhotiques avec EHm sont plus susceptibles une mort neuronale induite par hypotension. La combinaison de lEHm et lhypotension permet dexpliquer les complications neurologiques rencontres chez certains patients. Le diagnostic et le traitement de ce syndrome doit donc tre fait chez les patients cirrhotiques pour viter ces complications post-TH.
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Affiliation: Dpartement de microbiologie et immunologie, Facult de mdecine, Universit de Montral & Institut de Recherches Cliniques de Montral
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BACKGROUND: HIV-1 Vpu targets newly synthesized CD4 receptor for rapid degradation by a process reminiscent of endoplasmic reticulum (ER)-associated protein degradation (ERAD). Vpu is thought to act as an adaptor protein, connecting CD4 to the ubiquitin (Ub)-proteasome degradative system through an interaction with beta-TrCP, a component of the SCFbeta-TrCP E3 Ub ligase complex. RESULTS: Here, we provide direct evidence indicating that Vpu promotes trans-ubiquitination of CD4 through recruitment of SCFbeta-TrCP in human cells. To examine whether Ub conjugation occurs on the cytosolic tail of CD4, we substituted all four Ub acceptor lysine residues for arginines. Replacement of cytosolic lysine residues reduced but did not prevent Vpu-mediated CD4 degradation and ubiquitination, suggesting that Vpu-mediated CD4 degradation is not entirely dependent on the ubiquitination of cytosolic lysines and as such might also involve ubiquitination of other sites. Cell fractionation studies revealed that Vpu enhanced the levels of ubiquitinated forms of CD4 detected in association with not only the ER membrane but also the cytosol. Interestingly, significant amounts of membrane-associated ubiquitinated CD4 appeared to be fully dislocated since they could be recovered following sodium carbonate salt treatment. Finally, expression of a transdominant negative mutant of the AAA ATPase Cdc48/p97 involved in the extraction of ERAD substrates from the ER membrane inhibited Vpu-mediated CD4 degradation. CONCLUSION: Taken together, these results are consistent with a model whereby HIV-1 Vpu targets CD4 for degradation by an ERAD-like process involving most likely poly-ubiquitination of the CD4 cytosolic tail by SCFbeta-TrCP prior to dislocation of receptor molecules across the ER membrane by a process that depends on the AAA ATPase Cdc48/p97.
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Drak2 est un membre de la famille des protines associes la mort et cest une srine/thronine kinase. Chez les souris mutantes nulles Drak2, les cellules T ne prsentent aucune dfectuosit apparente en apoptose induite par activation, aprs stimulation avec anti-CD3 et anti-CD28, mais ont un seuil de stimulation rduit, compares aux cellules T de type sauvage (TS). Dans notre tude, lanalyse dhybridation in situ a rvl que lexpression de Drak2 est ubiquiste au stade de la mi-gestation chez les embryons, suivie dune expression plus focale dans les divers organes pendant la priode prinatale et lge adulte, notamment dans le thymus, la rate, les ganglions lymphatiques, le cervelet, les noyaux suprachiasmatiques, la glande pituitaire, les lobes olfactifs, la mdullaire surrnale, lestomac, la peau et les testicules. Nous avons cr des souris transgniques (Tg) Drak2 en utilisant le promoteur humain beta-actine. Ces souris Tg montraient des ratios normaux entre cellules T versus B et entre cellules CD4 versus CD8, mais leur cellularit et leur poids splniques taient infrieurs compar aux souris de type sauvage. Aprs activation TCR, la rponse prolifrative des cellules T Tg Drak2 tait normale, mme si leur production dinterleukine (IL)-2 et IL-4 mais non dinterfron-r tait augmente. Les cellules T Tg Drak2 actives ont dmontr une apoptose significativement accrue en prsence dIL-2 exogne. Au niveau molculaire, les cellules T Tg Drak2 ont manifest une augmentation moins leve des facteurs anti-apoptotiques durant lactivation; un tel changement a probablement rendu les cellules vulnrables aux attaques subsquentes dIL-2. Lapoptose compromise dans les cellulesT Tg Drak2 a t associe un nombre rduit de cellules T ayant le phnotype des cellules mmoires (CD62Llo) et avec des ractions secondaires rprimes des cellules T dans lhypersensibilit de type diffr. Ces rsultats dmontrent que Drak2 sexprime dans le compartiment des cellules T mais nest pas spcifique aux cellules T; et aussi quil joue des rles dterminants dans lapoptose des cellules T et dans le dveloppement des cellules mmoires T. En outre, nous avons recherch le rle de Drak2 dans la survie des cellules beta et le diabte. LARNm et la protine Drak2 ont t rapidement induits dans les cellules beta de llot aprs stimulation exogne par les cytokines inflammatoires ou les acides gras libres et qui est prsente de faon endogne dans le diabte, quil soit de type 1 ou de type 2. La rgulation positive de Drak2 a t accompagne dune apoptose accrue des cellules beta. Lapoptose des cellules beta provoque par les stimuli en question a t inhibe par la chute de Drak2 en utilisant petit ARNi. Inversement, la surexpression de Drak2 Tg a men lapoptose aggrave des cellules beta dclenche par les stimuli. La surexpression de Drak2 dans les lots a compromis laugmentation des facteurs anti-apoptotiques, tels que Bcl-2, Bcl-xL et Flip, sur stimulation par la cytokine et les acides gras libres. De plus, les expriences in vivo ont dmontr que les souris Tg Drak2 taient sujettes au diabte de type 1 dans un modle de diabte provoqu par de petites doses multiples de streptozotocine et quelles taient aussi sujettes au diabte de type 2 dans un modle dobsit induite par la dite. Nos donnes montrent que Drak2 est dfavorable la survie des cellules beta. Nous avons aussi tudi la voie de transmission de Drak2. Nous avons trouv que Drak2 purifie pouvait phosphoryler p70S6 kinase dans une analyse kinase in vitro. Lasurexpression de Drak2 dans les cellules NIT-1 a entran laugmentation de la phosphorylasation p70S6 kinase tandis que labaissement de Drak2 dans ces cellules a rduit la phosphorylation. Ces recherches mcanistes ont prouv que p70S6 kinase tait vritablement un substrat de Drak2 in vitro et in vivo. Cette tude a dcouvert les fonctions importantes de Drak2 dans lhomostasie des cellules T et le diabte. Nous avons prouv que p70S6 kinase tait un substrat de Drak2. Nos rsultats ont approfondi nos connaissances de Drak2 lintrieur des systmes immunitaire et endocrinien. Certaines de nos conclusions, comme les rles de Drak2 dans le dveloppement des cellules mmoires T et la survie des cellules beta pourraient tre explores pour des applications cliniques dans les domaines de la transplantation et du diabte.
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Le VIH-1 a dvelopp plusieurs mcanismes menant la dgradation de son rcepteur cellulaire, la molcule CD4, dans le but daugmenter la relche de particules virales infectieuses et dviter que la cellule soit surinfecte. Lun de ces mcanismes est la dgradation, induite par la protine virale Vpu, du CD4 nouvellement synthtis au niveau du rticulum endoplasmique (RE). Vpu doit lier CD4 et recruter lubiquitine ligase cellulaire SCF-TrCP, via sa liaison -TrCP, afin de dgrader CD4. Puisque CD4 doit tre retenu au RE pour permettre Vpu dinduire sa dgradation via le systme ubiquitine-protasome, il a t suggr que ce processus implique un mcanisme semblable une voie cellulaire de dgradation des protines mal-replies appele ERAD ( endoplasmic reticulum-associated degradation ). La dgradation par ERAD implique gnralement la dislocation des protines du RE vers le cytoplasme afin de permettre leur poly-ubiquitination et leur dgradation par le protasome. Nous avons dmontr que Vpu induit la poly-ubiquitination de CD4 dans des cellules humaines. Nos rsultats suggrent aussi que CD4 doit subir une dislocation afin dtre dgrad par le protasome en prsence de Vpu. De plus, un mutant transdominant ngatif de lATPase p97, qui est implique dans la dislocation des substrats ERAD, inhibe compltement la dgradation de CD4 par Vpu. Enfin, nos rsultats ont montr que lubiquitination sur des rsidus accepteurs de lubiquitine (lysines) de la queue cytoplasmique de CD4 ntait pas essentielle, mais que la mutation des lysines ralentit le processus de dgradation de CD4. Ce rsultat suggre que lubiquitination de la queue cytosolique de CD4 pourrait reprsenter un vnement important dans le processus de dgradation induit par Vpu. Lattachement de lubiquitine a gnralement lieu sur les lysines de la protine cible. Toutefois, lubiquitination sur des rsidus non-lysine (srine, thronine et cystine) a aussi t dmontre. Nous avons dmontr que la mutation de tous les sites potentiels dubiquitination cytoplasmiques de CD4 (K, C, S et T) inhibe la dgradation par Vpu. De plus, la prsence de cystines dans la queue cytoplasmique apparat suffisante pour rendre CD4 sensible Vpu en absence de lysine, srine et thronine. Afin dexpliquer ces rsultats, nous proposons un modle dans lequel lubiquitination de la queue cytosolique de CD4 serait ncessaire sa dgradation et o les sites dubiquitination de CD4 seraient slectionns de faon non spcifique par lubiquitine ligase recrute par Vpu. Enfin, nous avons observ que la co-expression dune protine Vpu incapable de recruter -TrCP (Vpu S52,56/D) semble stabiliser le CD4 qui est retenu au RE. De plus, dautres mutants de Vpu qui semblent capables de recruter -TrCP et CD4 sont toutefois incapables dinduire sa dgradation. Ces rsultats suggrent que lassociation de Vpu CD4 et -TrCP est essentielle mais pas suffisante pour induire la dgradation de CD4. Par consquent, ces rsultats soulvent la possibilit que Vpu puisse recruter dautres facteurs cellulaires pour induire la dgradation de CD4. Les rsultats prsents ont permis de mieux dfinir le mcanisme de dgradation de CD4 par Vpu dans des cellules humaines. De plus, ces rsultats nous ont permis dlaborer un modle dans lequel lubiquitine ligase cellulaire SCF-TrCP dmontre de la flexibilit dans le choix des rsidus ubiquitiner afin dinduire la dgradation de CD4. Enfin, ces tudes jettent un oeil nouveau sur le rle de Vpu dans ce processus puisque nos rsultats suggrent que Vpu doive recruter dautres partenaires cellulaires, mis part -TrCP, pour induire la dgradation de CD4.
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Linfection par le VIH-1 est caractrise par une dpltion progressive des cellules T CD4+ ainsi que par un dysfonctionnement des cellules T qui, en labsence de traitements anti-rtroviraux, conduit inluctablement la progression de la maladie vers le stade SIDA. Certains des mcanismes impliqus dans ce dysfonctionnement de la rponse cellulaire T ont t lucids et ont rvl un rle important de la molcule PD-1 dans lexhaustion des cellules T en phase chronique de linfection. En effet, des niveaux levs de PD-1 ont t associs une charge virale leve ainsi qu une diminution de la production de cytokines et de la capacit de prolifrer des cellules T spcifiques du virus. De plus, bloquer in vitro linteraction de PD-1 avec son ligand PD-L1 en utilisant un anticorps bloquant rtabli la fonction de ces cellules. De faon intressante, notre groupe ainsi que dautres quipes, ont montr que lexpression de PD-1 tait non seulement augmente sur les cellules spcifiques de lantigne mais aussi sur les cellules T totales. Cependant, peu de choses sont connues quant limpact de lexpression de PD-1 sur le renouvellement et la diffrenciation des cellules T qui expriment PD-1, et ce au cours de linfection. Lexpression de PD-1 na notamment pas t tudie en phase aigue de linfection. Nous montrons clairement que, aussi bien chez les individus en phase aigue quen phase chronique de linfection, lexpression de PD-1 est augmente sur toutes les sous-populations T, y compris les cellules naves. Nous avons galement mis en relief une distribution anormale des sous-populations T, ces cellules ayant un phnotype plus diffrenci, et ce tous les stades de la maladie. Dans cette thse, nous discutons le rle possible de PD-1 dans lhomostasie des cellules T chez les individus infects par le VIH-1. En tudiant la transition de la phase aigue la phase chronique de linfection, nous avons trouv que les sous-populations T CD8+ des individus rcemment infects exprimaient moins de PD-1 que celles des individus un stade plus avanc de la maladie. Ces niveaux plus levs de PD-1 sur les cellules T CD8+ en phase chronique sont associs des niveaux rduits de prolifration in vivo comme mesur par lexpression de Ki67 suggrant que lexpression de PD-1 est partiellement implique dans cette perte de fonction des cellules T CD8+. De plus, les cellules naves saccumulent en frquence lors de la transition de la phase aigue la phase chronique de linfection. Considrant que les cellules naves expriment dj des hauts niveaux de PD-1, nous avons mis lhypothse que lactivation initiale des cellules T chez les individus chroniquement infects est affecte. En rsum, nous proposons un modle o des hauts niveaux dexpression de PD-1 sont associs (1) un dysfonctionnement de la rponse cellulaire T CD8+ et (2) un dfaut dactivation des cellules naves ce qui contribue non seulement la progression de la maladie mais aussi ce qui va limiter lefficacit de potentiels vaccins dans linfection par le VIH-1 en empchant toute nouvelle rponse dtre initie. Afin de mieux dissquer la rponse immunitaire mise en place lors dune infection comme celle du VIH-1, nous avons dvelopp un outil qui permet de dtecter les cellules T CD4+ i.e. des ttramres de CMH de classe II. Ces ractifs ont pour but daugmenter lavidit du CMH de classe II pour son ligand et donc de dtecter des TCR de faible affinit. Dans cette thse, nous dcrivons une mthode originale et efficace pour produire diverses molcules de HLA-DR liant de faon covalente le peptide antignique. Mieux dterminer les mcanismes responsables de lexhaustion des cellules T dans linfection par le VIH-1 et de la progression de la maladie, ainsi que dvelopper des outils de pointe pour suivre ces rponses T, est central une meilleure comprhension de linteraction entre le virus et le systme immunitaire de lhte, et permettra ainsi le dveloppement de stratgies pertinentes pour lutter contre linfection par le VIH-1.
Resumo:
HIV upregulates cell-surface expression of specific ligands for the activating NKG2D receptor, including ULBP-1, -2, -3, but not MICA or MICB, in infected cells both in vitro and in vivo. However, the viral factor(s) involved in NKG2D ligand expression still remains undefined. HIV-1 Vpr activates the DNA damage/stress-sensing ATR kinase and promotes G2 cell-cycle arrest, conditions known to upregulate NKG2D ligands. We report here that HIV-1 selectively induces cell-surface expression of ULBP-2 in primary CD4+ T-lymphocytes by a process that is Vpr-dependent. Importantly, Vpr enhanced the susceptibility of HIV-1-infected cells to NK cell-mediated killing. Strikingly, Vpr alone was sufficient to upregulate expression of all NKG2D ligands and thus promoted efficient NKG2D-dependent NK cell-mediated killing. Delivery of virion-associated Vpr via defective HIV-1 particles induced analogous biological effects in non-infected target cells, suggesting that Vpr may act similarly beyond infected cells. All these activities relied on Vpr ability to activate the ATR-mediated DNA damage/stress checkpoint. Overall, these results indicate that Vpr is a key determinant responsible for HIV-1-induced upregulation of NKG2D ligands and further suggest an immunomodulatory role for Vpr that may not only contribute to HIV-1-induced CD4+ T-lymphocyte depletion but may also take part in HIV-1-induced NK cell dysfunction.
Resumo:
Le diabte auto-immun rsulte de la destruction des cellules bta pancratiques scrtrices dinsuline par les lymphocytes T du systme immunitaire. Il sensuit une dficience hormonale qui peut tre comble par des injections quotidiennes dinsuline dorigine exogne, toutefois il demeure ce jour impossible de gurir les patients atteints de la maladie. De faon gnrale, un systme immunitaire sain reconnat une multitude dantignes diffrents et assure ainsi notre dfense lgard de diffrents pathognes ou encore de cellules tumorales. Il arrive cependant que, pour des raisons gntiques et/ou environnementales, les lymphocytes T puissent sactiver de faon aberrante suite la reconnaissance dantignes provenant du soi. Cest ce bris de tolrance qui mne au dveloppement de pathologies auto-immunes telles que le diabte auto-immun. Afin de limiter lauto-immunit, des mcanismes de slection stricts permettent dliminer la majorit des lymphocytes T prsentant une forte affinit envers des antignes du soi lors de leur dveloppement dans le thymus. Certains de ces lymphocytes russissent toutefois chapper lapoptose et migrent en priphrie afin dy circuler en qute dun antigne spcifiquement reconnu. Il est alors primordial que des mcanismes priphriques assurent le maintien de la tolrance immunitaire en faisant obstacle lactivation et la prolifration des lymphocytes T auto-ractifs. Lune des avenues afin dinhiber le dveloppement de rponses immunitaires aberrantes est la gnration de lymphocytes T rgulateurs. Ces cellules, dorigine thymique ou priphrique, peuvent arborer diffrents phnotypes et agissent via de multiples mcanismes afin dinactiver et/ou liminer les cellules impliques dans lapparition de pathologies auto-immunes. Lutilisation de modles murins transgniques a permis la mise en vidence dune population peu caractrise de lymphocytes T au potentiel rgulateur. En effet, la proportion de ces cellules T nexprimant pas les corcepteurs CD4 et CD8 (double ngatives, DN) a t inversement corrle la prdisposition lauto-immunit chez ces ii souris. Lobjectif principal de cette thse est de dmontrer la fonction immuno-rgulatrice des lymphocytes T DN, tout en investiguant les facteurs gntiques responsables du maintien de cette population cellulaire. Nous avons observ que les lymphocytes T DN exercent une activit cytotoxique lgard des lymphocytes B de faon spcifique lantigne, via la libration de granules cytolytiques contenant du granzyme B et de la perforine. Par ailleurs, nous avons tabli quun unique transfert adoptif de ces cellules est suffisant afin dinhiber le dveloppement du diabte auto-immun chez des htes transgniques prdisposs la maladie. Le recours des souris dficientes pour lexpression du gne CD47 a permis de constater que la voie de signalisation CD47-Sirp est essentielle dans le maintien de la proportion des lymphocytes T DN. De plus, le locus murin de prdisposition au diabte auto-immun Idd13, qui contient le gne Sirp, a t identifi pour son rle dans la rgulation de la proportion de ces cellules. Finalement, une analyse gntique a rvl que dautres intervalles gntiques sont impliqus dans le contrle de la population des lymphocytes T DN. Parmi ceux-ci, un locus situ en rgion proximale du chromosome 12 a t valid grce la cration de souris congniques. Grce aux rsultats prsents dans cette thse, notre comprhension de la biologie ainsi que de la rgulation des lymphocytes T DN est approfondie. Ces connaissances constituent un pas important vers la cration de thrapies cellulaires novatrices permettant de prvenir et de gurir diverses pathologies auto-immunes.
